肺癌是导致人类癌性死亡的首位疾病，全球每年因肺癌死亡人数超过100万，其中80%～90%的患者为非小细胞肺癌，15%～25%为小细胞肺癌(small cell lung cancer， SCLC)，由于SCLC在肺癌各病理分型中分化程度最低，较早的发生血道转移，因此预后极差。临床上病理确诊为SCLC的患者，由于对化疗及其敏感，即使在外科治疗领域，也很少行手术治疗，而主要采取化疗，但很快就会产生耐药，癌肿不随化疗进程逐渐缩小，导致SCLC患者早期出现肿瘤进展、复发、转移的困境，5年生存率不足10%[1]。因此如何改善SCLC对化疗药物的耐药性是临床上需要解决的关键问题。ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)能利用水解ATP的能量将各种药物从细胞质内转运到细胞外[2]。前期基因芯片筛选结果表明，在SCLC耐药细胞株与亲本细胞株，ABCG2的表达有明显的差异，推测ABCG2在SCLC耐药方面起了重要作用。故本研究探讨ABCG2在SCLC化疗相关耐药的作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2010年2月至2014年8月我院经病理证实的SCLC患者23例为研究对象，年龄42～71岁，中位年龄55岁，并接受了顺铂和依托泊苷的规范联合化疗；部分患者因年龄、体质、家庭观念等拒绝化疗5例，未行规范化化疗2例，部分患者后续依从性欠佳，更改医疗机构及科室、无法取得联系共5例，合并有结肠癌肿瘤1例，共13例；保留10对完整的化疗前后的血液标本，其中局限期2例，广泛期8例，其中男7例，女3例；10例患者经化疗后均有效，其中8例患者行两周期化疗后肺部肿块及纵隔淋巴结明显缩小，2例肺部肿块缩小并内部空洞形成，10例患者出现肺部肿块进展、新发病灶、远处转移时提取其血液标本白细胞RNA荧光实时定量PCR检测H69AR/H69-ABCG2相对表达倍数。
1.2 细胞培养 细胞株H69、H69AR细胞购于美国ATCC公司。H69细胞：10%胎牛血清培养基(10 ml胎牛血清+90 ml PRMI-1640)；H69AR细胞：20%胎牛血清培养基(20 ml胎牛血清+80 ml PRMI-1640)。均放置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，H69AR细胞以无药与0.8 μmol/L的阿霉素交替培养，维持其耐药性，在高倍镜下观察细胞形态。
1.3 药物抑制率分析 CCK8分析不同浓度顺铂和依托泊苷对H69和H69AR的药物抑制率，CCK8试剂盒为广州威佳生物公司生产；全蛋白提取试剂盒为上海康成公司生产；BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天生物技术有限公司生产。利用CCK-8试剂盒在不同药物浓度下对两种细胞干预，酶标仪测定450 nm处的吸光度(O.D值)， 计算其抑制率。抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%， As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、毒性物质)；Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、无毒性物质)；Ab：空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基、CCK-8)。
1.4 H69、H69AR细胞总RNA的提取 抽取的临床血液标本立即采用Trizol试剂分别提取白细胞总RNA，并于-80 ℃冰箱保存。H69及H69AR细胞总RNA提取使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)按照说明书提取，变性后通过琼脂凝胶电泳法评价RNA质量，并通过分光光度计测量浓度。从每个样品中取2 μg使用cDNA合成试剂盒(宝生物科技公司生产)用于合成cDNA， cDNA的合成使用逆转录酶及9-nt随机引物。
1.5 基因芯片与荧光实时定量PCR 基因芯片为首都生物公司设计的人类基因组芯片，该芯片包含有21 522转录本，qRT-PCR在H69、H69AR细胞基因芯片证实了大量的基因表达有差异，明显上调基因的引物由Invitrogen公司合成，使用cDNA合成试剂盒合成cDNA，取10 μl的PCR反应试剂进行PCR反应，反应试剂包括1 μl RTproduct，1×PCR Master Mix，15 nmol/L正向引物 和15 nmol/L 负向引物。荧光实时定量PCR试验中的常用贮存液：10×MOPS电泳缓冲液：用400 ml DEPC水溶解NaAc·3H2O 4.10 g，然后加入20.90 gMOPS，溶解后再加1.86 g EDTANa2·2H2O，用IM灭过菌的NaOH调pH至7.0，用DEPC处理水定容至500 ml，0.22 μm 过滤器过滤，避光保存。通过PCR定量检测H69AR/H69-ABCG2相对表达倍数。
1.6 Western blot检测 鼠抗人单克隆ABCG2抗体购自SANTA公司，羊抗鼠抗体购自美国CHEMICON公司。内参选择GAPDH，PVDF膜购自Whatman公司； ECL发光试剂盒，X光胶片及影定影试剂均为上海康成公司生产。通过Western blot检测蛋白水平H69AR/H69-ABCG2表达情况。
1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。H69与H69AR蛋白免疫印迹灰度值分析采用方差分析化疗前与化疗后ABCG2的表达，QRT-PCR检测采用两样本t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 H69AR与H69细胞形态比较 两种细胞形态存在差异， H69细胞呈悬浮生长，但耐药细胞株H69AR细胞呈贴壁生长，细胞培养过程中发现增殖周期明显缩短，表现出较旺的生长能力。见图1。
2.2 不同浓度顺铂对H69和H69AR药物抑制率 两组细胞随着药物浓度的增加，药物抑制率是逐渐增加，相同药物浓度H69AR相对于H69细胞对顺铂耐药。顺铂作用于H69AR IC50=112.34 μg/ml，作用于H69 IC50=19.01 μg/ml。
2.3 不同浓度依托泊苷对H69和H69AR药物抑制率 两组细胞随着药物浓度的增加，药物抑制率是逐渐增加，相同药物浓度H69AR相对于H69细胞对依托泊甙耐药。依托泊甙作用于H69AR IC50=284.5 μg/ml，作用于H69 IC50=23.73 μg/ml。
2.4 实时荧光定量PCR结果 H69AR细胞的ABCG2表达量明显高于H69细胞，高出约95.5倍，经Western blot检测显示，H69AR细胞ABCG2蛋白表达要高于H69，且有统计学差异(F=20.501，P<0.05)。见图2。
2.5 产生耐药时ABCG2基因的表达 收集10例临床血液标本，对其化疗前后ABCG2的表达行QRT-PCR检测，结果显示，相比较化疗前，产生耐药时SCLC患者血液中ABCG2基因表达明显上调，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 产生耐药时SCLC患者血液中ABCG2基因表达上调情况
项 目abcdefghij采血时间/d102113961439411510989132106化疗周期5546455465耐药时肿块进展肿块进展脑转移新发病灶肿块进展肿块进展新发病灶脑转移肿块进展新发病灶与化疗前相比上调倍数2.333.656.884.433.6811.331.344.3619.27.22
注：F=11.45，t=3.238，P=0.003
3 讨 论
ABCG2首先在乳癌细胞中被发现，其功能是参与肿瘤细胞的多药耐药性。有研究证实ABCG2与乳腺癌、非小细胞肺癌耐药密切相关，ABCG2参与的多耐药机制目前研究认为ABCG2可以将大部分的化疗药泵出细胞外，导致细胞内化疗药物浓度降低，表现出肿瘤细胞对化疗药产生广泛耐药，也就是多耐药现象。
多耐药是肿瘤干细胞的重要特点，传统的观点认为，肿瘤组织的细胞呈完全的均一性，细胞与细胞之间无差别，肿瘤的复发只是因为放化疗没有完全的杀死肿瘤细胞，导致残留的肿瘤的细胞再次增殖，从而出现复发和转移。有研究发现，并不是所有的肿瘤细胞都有无限增殖的特点，所以，人们推测肿瘤组织中存在一种与人体干细胞相似的细胞，那就是肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的理论认为，肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织的极少量肿瘤细胞， 具有自我更新能力和分化潜能， 是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源，但是由于缺乏特异的表面标记，如何鉴定肿瘤干细胞，找出肿瘤干细胞的特异性的标志物成为目前研究的热点。
这项研究使用的H69细胞是从美国的一位男性SCLC患者的胸腔积液获得，经反复诱导耐药转化为H69AR细胞，已证实对阿霉素耐药，是目前国际上公认的多药耐药的SCLC模型，我们每隔1周予以低浓度的阿霉素加入培养基维持其耐药性。在SCLC亲本细胞株H69细胞与耐药细胞株H69AR培养过程中，H69AR细胞增殖周期要明显小于H69细胞，并且细胞的形态发生了明显的改变，呈贴壁成团生长，为了证实其是否存在多耐药性，我们分析了临床常用化疗药顺铂和依托泊甙对两种细胞抑制作用，结果证实了H69AR细胞对顺铂、依托泊甙存在交叉耐药现象。这些特点说明H69AR细胞相比较H69细胞更接近肿瘤干细胞。临床上治疗SCLC，初期治疗，化疗药物杀死的只是SCLC对药物敏感的非肿瘤干细胞，而能够适应、抵抗化疗药的肿瘤干细胞生存下来，继续增殖、分化。这样也可以解释为什么临床上一线化疗无效的时候，选择药物作用机理不同的化疗药物，也难以达到理想的效果。
Doyle等[3]首先在乳腺癌细胞株中检测到乳腺癌耐药蛋白，后来经研究发现此蛋白为ATP 结合转运ABCG2，有文献报道ABCG2与乳腺癌、非小细胞肺癌耐药密切相关，在SCLC研究方面，Wang等[4]等利用荧光激活细胞分选术成功的从SCLC细胞系H446分离出侧群细胞(side population，SP)与非侧群细胞(non-side population，NSP)发现SP有比NSP更强的增殖能力，并且SP细胞中CD133、ABCG2的mRNA表达水平显著高于NSP细胞，肿瘤SP细胞的特征虽然还不能完全等同于肿瘤干细胞，但实体肿瘤干细胞未找到更好的分选方式之前，分选SP细胞的方法在肿瘤干细胞研究是最为理想的方法，这项研究证实，ABCG2可能是肿瘤干细胞的理想标志物。Vesel等[5]研究发现ABCB1 和 ABCG2在SCLC经过顺铂治疗后表达上调是通过wnt信号通路来完成的。本研究发现，在H69AR细胞中，无论是mRNA水平，还是蛋白水平，ABCG2的表达量要明显高于H69细胞，也就是说在H69AR细胞形状改变的同时，内在的生物分子也在发生改变，耐药体系逐渐建立，趋于肿瘤干细胞特性，而ABCG2高表达起了重要的作用，ABCG2可能是肿瘤干细胞的分子标志物。
Kim等[6]研究发现MRP1、 MRP2、 MRP3、 ERCC1、 BRCA1的表达与化疗敏感性和生存率没有明显的关系，而ABCG2和化疗敏感性及生存率相关。Muller等[7]研究发现，以顺铂为基础的化疗含有ABCG2 421A等位基因的SCLC患者总生存率非常差。本研究中在SCLC患者经过规范化化疗过程中出现耐药时ABCG2在基因水平确实有高表达的现象出现，ABCG2可能参与了多耐药，那么近年来不断有关于ABCG2参与多耐药的药物研究。Zhang等[8]研究显示PD153035可以降低ABCG2蛋白的表达，并且可以增加化疗药物的抗肿瘤活性，有研究表明埃克替尼可对抗ABCG2引起的多药耐药，拉帕替尼不能抑制her2阳性的SCLC的扩增，但可以恢复SCLC对etoposide与SN-38的化疗敏感性，被证实是因为拉帕替尼阻断了ABC蛋白家族的转运作用，目前不乏ABCG2调节剂的研究等可以抑制ABCG2的功能，但由于其毒副作用无法应用于临床[9]。
综上所述，我们期待有特异性、毒副作用小的ABCG2调节剂发现并应用于临床，从而改善SCLC患者的预后。
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