± s )表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间的两两比较采用Scheffe检验。 P <0.05为差异有统计学意义。 黄安静 1 ，曾招军 1 ，张春来 2 ，周洪霞 3 ，董云朋 1 ，远 迪 1
(1.华北理工大学研究生学院，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市工人医院心内四科，河北 唐山 063000；3.华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室、唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北 唐山 063000)
【 摘要 】 目的 ：探讨阿托伐他汀对2型糖尿病大鼠心肌组织内质网应激相关因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的影响。 方法 ：将Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病心肌病模型组(DCM组)和阿托伐他汀治疗组(DCM+Ato组)。采取高脂肪饲料喂养加一次性腹腔注射链脲佐菌素的方式制备2型糖尿病心肌病大鼠模型，DCM+Ato组大鼠予阿托伐他汀干预8周。采用左室插管评估大鼠心功能，HE染色观察心肌组织病理学改变，TUNEL法测定心肌细胞凋亡水平，Western blot检测心肌组织的GRP78和CHOP蛋白表达量。 结果 ：DCM组较NC组细胞肥大，排列紊乱，形态不规则，DCM+Ato组较DCM组改善。与NC组比较，DCM组左室舒张末期压(LVEDP)显著升高，左室收缩压(LVSP)和左室压力上升或下降最大速率(LV±d p /d t max )显著降低，细胞凋亡率升高，GRP78、CHOP表达明显升高( P <0.05)；与DCM组比较，DCM+Ato组LVEDP显著降低，LVSP和LV±d p /d t max 显著升高，细胞凋亡率降低，GRP78、CHOP表达明显下降( P <0.05)。 结论 ：阿托伐他汀能有效减轻2型糖尿病大鼠的心肌病理损伤及改善心功能，可能与下调内质网应激相关因子GRP78、CHOP的表达，减少心肌细胞凋亡有关。
【 关键词 】 阿托伐他汀；糖尿病心肌病；内质网应激；葡萄糖调节蛋白78；CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白
糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖尿病(diabetes mellitus，DM)引起的心肌结构改变及功能异常 [1] ，已经成为糖尿病患者死亡的主要原因之一，作为DM独立的并发症逐渐被临床医生所重视。Ding等 [2] 研究发现在尿毒症小鼠心肌中内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)标志性蛋白GRP78及其诱导的凋亡途径相关蛋白CHOP的表达明显增加，在尿毒症性心肌病的发生发展中起到了关键作用，但ERS在DCM的发病过程中诱导心肌细胞凋亡的具体机制目前尚未明确。针对DCM，目前尚无特效的防治方案，因此找到有效的治疗药是非常重要的。近些年，他汀类药物在治疗心血管疾病方面的多效性备受关注，Xia等 [3] 研究发现阿托伐他汀通过下调GRP78、CHOP的表达减少心肌梗死后心力衰竭大鼠的心肌细胞凋亡，起到防治心衰的作用，然而他汀类药物是否能够以此为靶点防治DCM尚未得到证实。该研究制备DCM大鼠模型，给予阿托伐他汀进行干预，探讨阿托伐他汀对2型糖尿病大鼠心肌的保护效应及其作用机制。
1.1 材料与试剂 健康雄性Wistar大鼠36只，体质量(180±20)g，SPF级，6周龄，由华北理工大学实验动物中心提供。链脲佐菌素(美国Sigma公司)；血糖仪、血糖试纸(美国强生公司)；DAB试剂盒、Tunel细胞凋亡检测试剂盒、ACTIN多克隆抗体(沈阳万类生物科技有限公司)；CHOP单克隆抗体、GRP78多克隆抗体(美国Abcam公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组及建立模型 所有大鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分为NC组、DCM组、DCM+Ato组，各12只。DCM组和DCM+Ato组采用高脂肪饲料喂养，NC组采用普通饲料喂养，4周后，禁食不禁水12 h，DCM组和DCM+Ato组大鼠一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)2.5 mg/100 g(pH=4.5)，NC组注射等剂量的柠檬酸缓冲液，分别于第3、14天测大鼠空腹血糖(FBG)，连续两次FBG≥16.7 mmol/L，确定为2型糖尿病模型。DCM+Ato组大鼠给予阿托伐他汀1 mg /(100 g·d -1 )，对照组和DCM组给予等量生理盐水，灌胃8周。实验末测各组大鼠FBG≥16.7 mmol/L，同时DCM组和DCM+Ato组经左室插管评估心功能，心功能改变较NC组大鼠有意义的确定为2型DCM大鼠模型，实验末共33只大鼠(NC组12只，DCM组10只，DCM+Ato组11只)纳入实验，3只可能由于感染或酮症酸中毒死亡后予以剔除。
1.2.2 心功能检测 至灌胃8周末，对纳入实验的大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL/kg)使其麻醉，行气管插管安装呼吸机，将动脉导管经右侧颈总动脉逆行送入左室，稳定数分钟以后，测定LVEDP、LVSP和LV±d p /d t max 。
1.2.3 HE染色 将各组大鼠处死，取心脏组织用4%中性甲醛充分固定后，制作石蜡切片，行HE常规染色。光镜下观察心肌病理损害。
1.2.4 TUNEL检测 TUNEL法测定心肌细胞凋亡，石蜡切片常规脱蜡至水，用蛋白酶K室温孵育15～30 min，滴加50 μL的TUNEL反应混合溶液37 ℃孵育60 min，加入50 μL转化剂-POD 37 ℃孵育30 min，加入DAB底物溶液显色，苏木素复染细胞核，封片，在光镜下进行图像分析。每张切片在高倍镜下随机选取5个视野，计算凋亡的心肌细胞数占细胞总数的百分比，得出凋亡指数(apoptotic index，AI)。
1.2.5 Western blot 取心肌组织提取蛋白，测定浓度，进行SDS-PACE电泳分离蛋白，将目的条带用电转印法转至PVDF膜上，封闭后分别孵育一抗GRP78(1∶500稀释)和CHOP(1∶500稀释)，4 ℃过夜，室温孵育二抗(1∶3000稀释)，显影，以ACTIN作为内参照，用自动图像分析软件Image J进行半定量分析。每个蛋白重复3次实验。
1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件，数据以均数±标准差( ± s )表示，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间的两两比较采用Scheffe检验。 P <0.05为差异有统计学意义。
2.1 心功能检测结果 心功能指标中LVSP、LV+d p /d t max 反映心脏的收缩功能，LVEDP、LV-d p /d t max 反映心脏的舒张功能。结果显示：与NC组比较，DCM组大鼠LVEDP明显升高，LVSP和LV±d p /d t max 明显降低( P <0.05)；经阿托伐他汀干预后，与DCM组比较，DCM+Ato组大鼠LVEDP明显降低，LVSP和LV±d p /d t max 明显升高( P <0.05)。见表1。
表 1 各组大鼠心功能指标的检测结果 ( 
x ± s )
注：1)与NC组比较 P <0.05；2)与DCM组比较 P <0.05
2.2 心肌组织病理学改变 HE染色显示：NC组心肌纤维排列整齐、致密，细胞结构清晰，细胞核大小均一；DCM组心肌纤维排列紊乱、稀疏，出现断裂，心肌细胞肥大变性，细胞核大小不一，细胞间质变宽，满视野见炎性细胞；DCM+Ato组有类似DCM组大鼠心肌病理学改变，但程度显著减轻。
2.3 心肌细胞凋亡检测结果 TUNEL染色显示：正常心肌细胞的胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞的胞核呈棕黄色。NC组可见少量凋亡心肌细胞，DCM组较NC组凋亡心肌细胞明显增多( P <0.05)，DCM+Ato组较DCM组凋亡心肌细胞明显降低( P <0.05)，但仍高于NC组( P <0.05)。见表2。
表 2 各组大鼠心肌组织细胞 AI、GRP78、CHOP 定量表达比较 
注：1)与NC组比较 P <0.05；2)与DCM组比较 P <0.05
2.4 心肌组织的GRP78和CHOP蛋白表达情况 Western blot检测显示：与NC组比较，DCM组大鼠心肌组织GRP78和CHOP表达水平显著升高( P <0.05)；与DCM组比较，DCM+Ato组大鼠心肌组织GRP78和CHOP表达水平明显降低( P <0.05)。见表2。
DCM的发病机制是复杂和多因素的，虽然对DCM分子病因的研究已经取得了相当大的进展，但人们对此仍然知之甚少。糖尿病患者体内的脂毒性、炎症因子增加、氧化应激等因素，可以使心肌细胞内质网内未折叠蛋白或者错误折叠蛋白堆积，诱发ERS产生 [4] 。GRP78属于HSP70家族，是ERS过程中最重要的分子伴侣，灵敏地监测着内质网中蛋白的折叠加工情况，随时进行修正，当ERS被激发时，其表达量显著增加，被认为是ERS的标志性蛋白 [5] 。在严重或持续应激状态下，GRP78表达的上调不能够维持细胞稳态时，一种ERS特异的凋亡转录因子——CHOP便被激活。CHOP又名生长抑制和DNA损伤153，ERS上游的IRE1、PERK、ATF6这3条信号传导通路，都能够激活CHOP基因的转录，诱导细胞凋亡，促进疾病进展 [6] 。Fu等 [7] 在主动脉狭窄导致的心力衰竭小鼠模型中证实了CHOP基因缺失的细胞可以抵抗ERS介导的细胞凋亡，说明在ERS过程中CHOP介导的凋亡通路起到非常重要的作用。心肌细胞凋亡导致心肌细胞丢失，参与心肌重构，是心肌病发生发展的重要致病因素 [8] 。Wang等 [9] 研究发现内质网应激参与了缺血再灌注大鼠的心肌损伤，通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡，可以减轻心室重构，改善心脏收缩功能。
他汀类药物在治疗心血管疾病方面有许多调节血脂以外的作用，Burma等 [10] 报道瑞舒伐他汀可以通过抗炎、抗氧化作用减轻心肌缺血再灌注大鼠的心肌损伤，还有研究发现他汀类药物可以通过改善血管内皮功能障碍发挥抗动脉粥样硬化作用 [11] 。近年来对他汀类药物的研究逐渐深入，发现其可以通过减少心肌细胞凋亡，发挥心血管保护作用 [12-14] 。心肌细胞凋亡也参与了糖尿病心肌病的发生发展 [15] ，阿托伐他汀是否能抑制内质网应激引起的心肌细胞凋亡，从而发挥防治糖尿病心肌病的作用目前少有报道。
本研究采用HFD联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法制作DCM大鼠模型 [16] ，给予阿托伐他汀进行干预。与NC组相比，DCM组大鼠心肌病理损伤显著，LVEDP明显升高，LVSP和LV±d p /d t max 明显降低，提示大鼠心功能降低，表明DCM大鼠模型制备成功；且DCM组大鼠心肌内GRP78、CHOP表达明显增多，心肌细胞凋亡指数明显升高，提示DCM大鼠心肌中存在ERS诱导的心肌细胞凋亡。与DCM组相比，DCM+Ato组大鼠心肌病理损伤明显减轻，GRP78、CHOP表达明显减少，心肌细胞AI明显下降，LVEDP明显降低，LVSP和LV±dp/dtmax明显升高，提示阿托伐他汀能明显减轻DCM大鼠心肌组织病理学损伤及抑制DCM大鼠的心肌细胞凋亡，从而有效改善心脏功能紊乱，且这种对于DCM大鼠的心脏保护作用可能与下调GRP78、CHOP的表达，抑制内质网应激引起的心肌细胞凋亡有关。
综上所述，ERS介导的心肌细胞凋亡在DCM的发生发展过程中起到重要作用，阿托伐他汀通过抑制ERS中CHOP相关凋亡通路产生心脏保护作用，改善心功能，为临床治疗糖尿病心肌病提供了实验依据。然而DCM的发生机制复杂，因此，深入研究他汀类药物的心脏保护机制，将对DCM的防治有着重大意义。
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HUANG Anjing 1 ，ZENG Zhaojun 1 ，ZHANG Chunlai 2 ，ZHOU Hongxia 3 ，DONG Yunpeng 1 ，YUAN Di 1
(1.College of Graduate School，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Fourth Department of Cardiology，Tangshan Worker′s Hospital，Tangshan，Hebei 063000，China；3.School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China)
【 Abstract 】 Objective : To investigate the influences of atorvastatin on the expression of endoplasmic reticulum stress-related factors of CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP) and glucose-regulated protein of 78kD(GRP78) in the myocardial tissue of type 2 diabetic rats. Methods : Wistar rats were randomly divided into normal control group(NC group)，diabetic cardiomyopathy model group(DCM group) and atorvastatin treatment group(DCM+Ato group).A rat model of type 2 diabetic cardiomyopathy was established by feeding with high fat diet and injecting intraperitoneally with low dose of streptozotocin.The rats in DCM+Ato group received atorvastatin intervention for 8 weeks.Left ventricular catheterization was used to evaluate the cardiac function of rats.Histopathological changes of myocardium were observed by HE staining.TUNEL assay was applied to determine the apoptosis of myocardial cells.The expression levels of GRP78 and CHOP in myocardial tissue were detected by Western blot. Results : Compared with NC group，the cells were hypertrophic，arranged in disorder and irregular in shape in group DCM，while all of these had been ameliorated in DCM+Ato group.Compared with NC group，LVEDP increased；LVSP，the maximal rate of the increase or decrease of left ventricular pressure(LV±d p /d t max ) decreased；the levels of myocardial apoptosis，and the expression levels of GRP78 and CHOP increased in DCM group( P <0.05).Compared with DCM group，LVEDP decreased；LVSP，LV±d p /d t max increased；the levels of myocardial apoptosis，and the expression levels of GRP78 and CHOP decreased in DCM+Ato group( P <0.05). Conclusion : Atorvastatin can affectively improve the cardiac function in rats with type 2 diabetic cardiomyopathy，which may be related to the down-regulation of the expression of GRP78 and CHOP resulting in the decrease of myocardial apoptosis.
【 Keywords 】 atorvastatin；diabetic cardiomyopathy；endoplasmic reticulum stress；glucose-regulated protein of 78kD；CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein
通信作者： 张春来，120zcl@sina.com
优先数字出版地址： http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20180921.1613.030.html
DOI: 10.11851/j.issn.1673-1557.2018.05.013
【文献标识码】 A
【 中图分类号 】 R574.62
(收稿日期： 2017-07-07)