种植义齿是牙列缺损及缺失的常见的修复方式之一，大约30%的种植修复的患者会发生种植体周围炎[1]，这种复杂的炎症及免疫病理过程是导致种植体失败的主要原因。菌斑是种植体周围组织炎症的主要致病因素，炎症微环境可以导致破骨作用，使支持骨丧失，最终导致种植义齿修复失败。研究证实，种植体周围炎的发生直接影响种植牙的成功率。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成。种植体周围炎治疗的传统方法，包括局部清创、刮治及抗菌药物应用，整体治疗效果并不十分理想。并且抗菌药物应用因其对宿主细胞毒性及细菌的耐药性，使其应用具有一定争议[2]。本试验以体外培养种植体周围炎来源及正常组织来源的人成骨细胞(osteoblast，OB)为研究对象，重点观察炎性微环境对成骨细胞增殖、分化成熟方面的影响。为抑制牙周炎、种植体周围炎等所致牙槽骨的吸收，促进骨再生提供理论依据，促进种植修复技术的临床推广。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胎牛血清、胰蛋白酶、 培养液DMEM(Gibco公司)、茜素红(AZR)染料、二甲基亚砜(DMSO)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色及活性试剂盒、骨钙素(osteocalcin，OCN)放免试剂盒。

1.2 成骨细胞原代分离培养 取种植体脱落患者种植窝中骨组织及口腔颌面外科手术中获得的无菌骨碎片，在DMEM 全培养液中轻刮骨内表面并反复冲洗，将骨片剪成碎片，将其置入培养瓶中。培养瓶倒置放入CO2培养箱，静置4 h后，取出培养瓶小心翻转。每3 d换液1次，每次换液后在倒置显微镜下观察细胞形态、运动及贴壁情况。待细胞数量足够，0.25%胰酶消化传代。

1.3 细胞形态学观察与功能鉴定 (1)ALP染色：将细胞爬片3 d后取出，按照试剂盒说明书染色，光镜观察。(2)钙结节染色：将细胞爬片18 d后取出，茜素红染色5 min，二甲苯透明，树胶封固，光镜观察。

1.4 进行炎性微环境对成骨细胞功能影响的试验

1.4.1 试验分组 将种植体周围炎来源成骨细胞组设为试验组，将正常组织来源成骨细胞组设为对照组。

1.4.2 成骨细胞增殖能力检测(MTT法) 取传代第三代细胞，胰蛋白酶消化离心加入DMEM培养液，形成OB混悬液，接种于96孔板。每24 h每组取3孔，收集细胞，加入MTT溶液孵育4 h，加二甲基亚砜，酶标仪测定490 nm处各管吸光度值(A值)，绘制生长曲线。整个试验重复3次。

1.4.3 碱性磷酸酶活性 取传代第三代细胞，培养72 h后，收集细胞测定各管OD值。根据计算公式计算出蛋白含量。按照AKP测定试剂盒说明书操作，据计算公式计算出各组细胞匀浆液AKP的含量。整个试验重复3次。

1.4.4 骨钙素检测 取传代第三代细胞，培养72 h后，收集细胞上清液作骨钙素检测。按骨钙素放射免疫试剂盒所提供的放射免疫法(RIA)测定细胞分泌到培养基中的骨钙素含量。整个试验重复3次。

1.5 统计学处理 试验所得数据应用Microsoft Excel及SPSS 11.5软件，采用独立样本t检验进行两组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 培养后成骨细胞的鉴定

2.1.1 细胞形态学观察 两种来源细胞原代培养第1天，贴壁的细胞开始形成突起。此时细胞体积小，呈短梭形、三角形或多边形。随着传代次数的增加，细胞以三角形及方形为主，生长快而稳定，就细胞形态而言，两组细胞无明显差异。

2.1.2 碱性磷酸酶染色 两种来源细胞传3代以后，ALP染色显示大部分培养细胞呈阳性，细胞浆有蓝染颗粒或块状沉淀，为ALP阳性反应。但对照组比试验组细胞内可见更多染色颗粒。

2.1.3 钙结节染色 细胞生长8～14 d细胞融合后继续培养，即呈多层生长，培养18～30 d，倒置显微镜下观察可见在瓶底的不透光结节，茜素红染色可见结节处有橘红色钙盐沉积，证实为钙化结节。对照组比试验组细胞内可见更多钙结节。

2.2 成骨细胞成骨功能观察

2.2.1 成骨细胞增殖能力测定 结果表明，两组细胞都表现了一定的增殖能力，对照组增殖能力明显高于试验组，从贴壁培养第4天，两组细胞增殖能力有显著性差异(P<0.05)。

2.2.2 碱性磷酸酶(ALP)活性 试验组ALP活性(4.21±0.25)U/gprot，对照组ALP活性(8.91±0.29)U/gprot，组间差异有统计学意义(P<0.01)，表明两组均可使成骨细胞ALP活性增强，对照组ALP活性高于试验组。

2.2.3 骨钙素(OCN)检测 试验组OCN含量(2.40±0.26)ng/mL，对照组OCN含量(3.40±0.36)ng/mL，组间差异有统计学意义(P<0.01)，表明两组均可使成骨细胞OCN含量增加，对照组OCN表达高于试验组。

3 讨 论

种植义齿修复经过长期的基础研究和临床应用，已经逐渐普及，与之相应的种植体周围炎的患者日趋增多，因种植体周围骨吸收导致种植体脱落占脱落种植体的97.06%，现已成为种植修复一大难题。

种植体周围炎早期主要研究相关炎症细胞因子及细菌微生物对骨细胞的影响，与骨吸收的关系，研究已证实龈沟液中IL-1α、IL-6、TNF-α等炎症细胞因子参与炎症过程 ，与界面骨破坏有关[3]。目前，在种植体周围炎的治疗上，针对细胞及免疫病理方面的研究较多，Bhattarai等[4]证实，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)主要表达于脂肪组织和免疫系统，通过结合壳聚糖纳米金粒子，在植入物表面可以诱导成骨细胞矿化，抑制种植体周围炎。还有学者研究釉基质衍生物可以影响植入物表面OB的增殖及分化，褪黑素可以调节成骨细胞的代谢[5-6]，都具有一定的应用前景。丁元圣等[7]研究表明，含氟镁合金正畸微种植体可促进成骨细胞增殖，对种植体周围炎能起到一定的抑制作用。常压低温等离子体(cold atmospheric plasma，CAP)能够破坏细菌生物膜，增加钛表面润湿度，有利于成骨细胞的附着，可能被用于种植体周围炎的治疗[8]。骨形成蛋白2和牙周膜干细胞在种植体周围炎形成的缺损处可增加新骨的形成，并重新形成骨整合[9]。骨形成蛋白2/7异质二聚体也可增加骨再生[10]。

成骨细胞的鉴别除细胞形态外主要依靠成骨细胞的特异性分泌蛋白，如碱性磷酸酶、骨钙素及体外矿化的功能特征。长期以来各研究者均以具有以上特征作为成骨细胞鉴定标准，因而将这些特点称为成骨细胞表型标志[11-12]。

本试验细胞通过形态学同时结合成骨细胞的3项特征性指标，证实培养的细胞为成骨细胞，并有钙化能力。种植体周围炎来源的成骨细胞的增殖及分化能力均低于正常组织来源的成骨细胞。这是由于种植体周围炎的炎性微环境抑制了成骨细胞的增殖能力。种植体周围炎来源的成骨细胞由于在炎性微环境下降低了OCN 的表达，与以往研究相符合[13]。种植体与颌骨的骨结合区骨密度越高，种植体与骨的结合率就越高[14]。

炎性微环境下成骨细胞的生物学功能受多方面调控，通过对比可以确定炎性微环境下成骨细胞的生物学功能受到影响，成骨分化及矿化能力显著降低，这是导致种植体周围骨组织吸收的主要原因[15]。本试验在细胞层面进一步探讨种植体周围炎的病因，从而为疾病防治提供了方向。

参考文献：

[1]SCHMINKE B， ORDE F V， GRUBER R， et al. The pathology of bone tissueduring peri-implantitis[J]. J Dent Res， 2015， 94(2)： 354-361.

[2]BUSSCHER H J， VAN DER MEI H C， SUBBIAHDOSS G， et al. Biomaterial-associated infection： locating the finish line in the race for the surface[J]. Science Translational Medicine，2012， 4： 153rv10.

[3]徐淑兰，张开宜，许曼波，等.实验性种植体周围炎龈沟液炎症细胞因子浓度的检测分析[J].广东牙病防治，2003(2)：30-32.

[4]BHATTARAI G， LEE Y H， LEE N H， et al. PPAR delivered by Ch-GNPs onto Titanium surfaces inhibits implant-induced inflammation and induces bone mineralization of MC-3T3E1 osteoblast-like cells[J]. Clin Oral Implants Res， 2013， 24(10)： 1101-1109.

[5]QU Z， ANDRUKHOV O， LAKY M， et al. Effect of enamel matrix derivative on proliferation and differentiation of osteoblast cells grown on the Titanium implant surface[J]. Oral Surgery， Oral Medicine， Oral Pathology， Oral Radiology， and Endodontology， 2011， 111(4)： 517-522.

[6]PROKSCH S， STROBEL S L， VACH K A， et al. Melatonin as a candidate therapeutic drug for protecting bone cells from chlorhexidine-induced damage[J]. J Periodontol， 2014， 85(12)： E379-E389.

[7]丁元圣，赵玥，郭睿，等.不同正畸微种植体对骨结合和种植体周围炎的影响[J].医学信息，2015，28(26)：69-70.

[8]DUSKE K， JABLONOWSKI L， KOBAN I， et al. Cold atmospheric plasma in combination with mechanical treatment improves osteoblast growth on biofilm covered Titanium discs[J]. Biomaterials， 2015， 52： 327-334.

[9]PARK S Y， KIM K H， GWAK E H， et al. Ex vivo bone morphogenetic protein 2 gene delivery using periodontal ligament stem cells for enhanced re-osseointegration in the regenerative treatment of peri-implantitis[J]. J Biomed Mater Res A， 2015， 103(1)： 38-47.

[10]SUN P， WANG J X， ZHENG Y N， et al. BMP2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration in peri-implant bone defects model than BMP2 or BMP7 homodimer[J]. Dent Mater J， 2012， 31(2)： 239-248.

[11]闫爱民，刘力，陈秉礼，等.兔胚成骨细胞移植修复异体兔骨缺损的实验研究[J].创伤外科杂志，2003，5(2)：110-113.

[12]XU Y H， SHI X Y， HU Y Y， et al. The histocompatibility of true bone ceramic and cultured rabbit poriatoum osteoblast in vitro[J]. Fourth Mil Med Univ， 2000， 21(4)： 512-514.

[13]PACIOS S， ANDRIANKAJA O， KANG J， et al. Bacterial infection increases periodontal bone loss in diabetic rats through enhanced apoptosis[J]. Am J Pathol， 2013， 183(6)： 1928-1935.

[14]REICH K， TANGL S， GOLDHAHN J， et al. Cortical porosity of the mandible in an osteoporotic sheep model[J]. Osteoporosis International， 2010， 21(1)： 311.

[15]吴昊，刘洪臣，鄂玲玲，等.种植体周围炎对颌骨成骨细胞生物学功能的影响[J].华西口腔医学杂志，2014，32(2)：130-133.