刘艳婷，肖光军
(遂宁市中心医院 检验科，四川 遂宁 629000)
【摘要】血氨检测是临床常用的蛋白质代谢产物检测项目之一，由于目前临床血氨检测的标本量较少，且影响检测结果的因素较多，相关人员培训不到位则会导致检测结果的差异大、准确性差，从而严重影响临床的诊疗工作。本文对影响血氨检测结果的因素作一综述并提出改进方法，以供同行参考。
【关键词】血氨；检测；影响因素
血氨在正常人体内含量极低，主要来源于肠道中未被吸收的氨基酸、未消化的蛋白质、由血液中渗入肠道中的尿素经大肠埃希菌作用脱氨基生成及蛋白质代谢过程中生成[1]，其含量检测是临床常用的蛋白质代谢产物检测项目之一[1]，主要用于肝性脑病的诊断及疗效评价、肝功能衰竭的评价、肝性昏迷的鉴别诊断以及Reye综合征、3H综合征的诊断[2]。由于目前临床血氨检测的标本量较少，且影响检测结果的因素较多，相关人员培训不到位则会导致检测结果的差异大、准确性差，从而严重影响临床的诊疗工作。本文对血氨检测的常见方法进行介绍，同时对血氨检测影响因素的研究进展进行综述。
1.1 抗凝剂对检测结果的影响 血液在凝固的过程中会产生氨导致检测结果升高，所以应避免使用血清作为标本。临床常用的抗凝剂有EDTA、肝素、枸橼酸钠及氟化钠，EDTA和枸橼酸钠通过与血液中的钙离子形成稳定的螯合物而阻止血液凝固，但因使用枸橼酸钠抗凝时抗凝剂会释放出氢离子(H+)引起红细胞形态改变导致细胞膜的通透性改变，从而使红细胞内的氨进入血浆中引起检测结果增高[3-4]，故血氨检测时标本不宜使用枸橼酸钠抗凝；肝素则通过对抗凝血活酶及凝固酶的形成和活性从而阻止血液凝固，同时能抑制腺苷酸脱氨酶以减少血氨的生成[3]；使用氟化钠抗凝剂抗凝时可使检测结果增高，不宜使用。所以血氨检测时，国外常使用EDTA抗凝，国内则首选肝素抗凝[1]。使用肝素抗凝时，因其为一种酸性黏多糖，属于一种阴离子多聚电解质，和阳离子有不同的亲和力，与氨有聚合作用，从而使血氨检测结果偏低。潘婕等[5]使用肝素抗凝管及EDTA-K2抗凝管分别采集30份同一健康成人空腹静脉血，离心处理后立即使用干化学法检测血氨含量，发现肝素抗凝管检测血氨为(20.2±16.7)μmol/L，明显低于EDTA-K2抗凝管的(34.4±16.7)μmol/L；赵然等[6]也进行了相关研究，结果一致。另一方面，因肝素是从动物组织特别是小肠黏膜中提取的硫酸化葡糖胺聚糖化合物，厂家在生产的过程中可能会受到氨污染而未将氨彻底去除，同时肝素在酸性环境中抗凝作用下降，而在碱性条件如硫酸铵溶液中则相当稳定，因此不排除个别厂家生产的肝素抗凝管中含有少量铵盐物质以保证其高抗凝活性。抗凝剂浓度过高时，肝素抑制腺苷酸脱氨酶以减少血氨生成的能力可能不足以抵消抗凝管所含氨对检测结果的影响，从而致血氨检测结果偏高，出现正干扰[7]。高月亭等[7]、张国辉等[8]发现肝素浓度控制在10～40 U/mL以内时对检测结果无影响，且具有高抗凝力及抑制腺苷酸脱氨酶的作用，故使用肝素抗凝时，应注意抗凝管的选择，抗凝剂浓度应控制在10～40 U/mL以内。不同厂家生产的抗凝管可能含有不同的物质，建议医院内各科室均使用同一厂家生产的抗凝管采集标本，一旦抗凝剂类型或真空采血管生产厂家改变后，应重新建立正常人群的参考区间，否则将影响临床医生的诊疗工作。
1.2 标本状态对检测结果的影响
1.2.1 溶血 正常情况下，人体血液中的氨在肝脏的代谢作用下，血浆中氨的含量处于一个较低的水平，而红细胞内因含有大量的谷氨酸氨基转移酶及γ-谷氨酰氨基转移酶，这些酶在红细胞内可使氨基酸脱氨生成大量血氨，导致红细胞内血氨浓度是血浆中血氨浓度的23倍[1]，标本一旦发生溶血，其检测结果就会升高，并随溶血严重程度的增加而增加。因此，标本采集时应规范操作，混匀时动作应轻柔，避免标本溶血引起检测结果假性增高；同时，检验科应严格执行实验室标本接收制度，对溶血标本拒收，以确保标本的质量。
1.2.2 高胆红素 使用谷氨酸脱氢酶法或干化学法检测血氨时，标本中高浓度的胆红素会吸收一定的光波，将影响检测过程中吸光度或反射光的变化而影响检测结果；同时，胆红素经血红素加氧酶作用后生成胆绿素，再经还原酶作用生成间接胆红素的过程中可提供2个H+，起到抗氧化的作用[9]，其大量存在时则影响谷氨酸脱氢酶法中的氧化反应，对血氨检测造成干扰。宋玉梅等[9]研究发现，总胆红素≤85.0 μmol/L的标本血氨检测结果受总胆红素的干扰影响小，而总胆红素>85.0 μmol/L时干扰影响大，可通过稀释标本来降低干扰，以减小测定误差。
1.2.3 脂血 脂血标本血浆中的水分被不可溶的脂浊微粒所取代，对大多数成分造成负干扰，并使血浆中被检测物质分布不均，导致检测过程中的随机误差增大，从而对血氨检测的不同方法均造成干扰；另一方面，脂浊对光线有一定的散射作用，对吸光度产生正干扰，影响谷氨酸脱氢酶法检测血氨。为减小脂血对检测结果的影响，可将脂浊的血浆加盖密封后经高速离心机离心处理吸取下层血浆进行检测[10]。
1.3 标本运输及保存对检测结果的影响
1.3.1 标本的运输 标本采集后，血浆中的多肽、谷氨酰酶等即可在谷氨酸氨基转移酶及γ-谷氨酰氨基转移酶的作用下水解释放出氨，即使储存在0 ℃，放置15 min以上即可使血氨浓度升高[1]；在25 min时，血氨浓度增高速率约为0.017 μg/(min·mL)血液[1]；另一方面，若放置时间过久，红细胞内的氨也会释放到血浆中，引起血氨的浓度升高。因此，标本采集后应标明采集时间，立即垂直放置于冰水中送检，送检时应避免剧烈震荡。在大部分医院的实际工作中，标本仍采用人工运输的方式送检，且很多血氨检测的标本未放置于冰水中，医生分析结果时应充分考虑放置时间、温度等因素对血氨结果的影响。而随着气动物流传输系统技术的不断成熟，部分医院检验科的标本已由传统的人工运输改为气动物流传输系统运送，在采样后几分钟内即可准确送达实验室，从而解决了标本放置时间和温度对检测结果的影响，但标本在传送过程中因有方向的变换和较强的撞击力，可能引起溶血导致检测结果升高，需在传输桶内放置泡沫海绵等缓冲物对标本进行固定、防震处理，并采用低速传输[11]。
1.3.2 标本的保存 检验科收样后应立即低温离心分离出乏血小板血浆并在采样后30 min内完成检测，若不能及时检测，应将血浆吸出密封保存于4 ℃冰箱中并在2 h内完成检测，或保存于-20 ℃冰箱中并在24 h内完成检测[12-14，2]；也有文献报道使用分离胶管采集的标本经离心后血清与血细胞之间形成胶状隔离层，阻止血细胞产生的氨进入血清中，离心后可直接放入4 ℃冰箱中保存4 h[5]，但因血液在凝固过程中可致血氨浓度升高，现临床应用较少。
2.1 离子交换法 此方法具有特异性好、精密度及准确度高的优点，但因其操作烦琐而不适合临床应用[15]。
2.2 离子选择电极法 此方法准确性及精密度较好，但电极的稳定性受多种因素的影响，尚难以在临床普及使用[3]，需进一步研发。
2.3 谷氨酸脱氢酶法 随着全自动生化分析仪的普及使用，此方法已成为临床血氨检测的首选方法[1]，具有特异性高、标本用量少、快速的优点。现多采用液体双试剂，在R1中加入少量乳酸脱氢酶，将血浆中干扰氨测定的丙酮酸在预反应中除去，然后氨在足量的谷氨酸脱氢酶作用下与过量的α-酮戊二酸、NAD(P)H反应，在一定条件下340 nm吸光度的下降与标本中血氨浓度成正比，通过与同样处理的标准液比较，即可计算出标本中氨的含量。虽然试剂盒中加入了适量非离子表面活性剂以降低脂类的干扰，加入少量EDTA以防止金属离子的干扰以增加试剂的稳定性，以及加入了适量蛋白质保护剂以保障酶的稳定性，但在实际工作中发现，酶法检测结果的重复性较差，可能与标本中血氨含量低易受到环境及仪器携带污染等因素的干扰有关[16-17]，因此在做定标、质控及标本检测前，应对反应杯及试剂加样针进行特殊清洗[16-17]，不宜与其他检测项目一起同时检测。部分厂家(如北京利德曼)生产的试剂需配制成工作液后方可使用，使用时应现配、少配；为节约试剂可将检测后未用完的试剂从试剂仓取出密封后放置于2～8 ℃冰箱中保存(不宜超过5 d)[12]，用时再从冰箱取出上机，并做定标和质控，以保证结果的准确性。
2.4 干化学法 干化学法检测血氨，标本加样后所有的反应均在一张干片中进行，并可通过分布层去除大分子物质的干扰(如脂浊微粒)，血浆中氨通过半透膜到达指示层与氨指示剂发生反应呈深蓝色，颜色的深浅与标本中氨含量成正比，然后通过反射光度计检测反射光来计算结果。此方法不需管道系统、试剂加样系统及特定反应杯，不需去离子水冲洗，从而避免交叉污染，且操作简便、反应快速，是临床血氨检测的常用方法。但试剂干片受潮、标本加样位置不准确、光源不稳定等因素均会导致检测结果不准确[18]，可通过以下措施来减小误差：血氨检测标本量较少，可将试剂干片更换为小包装，上机后使用时间不能超过5 d[19]；定期更换干片储藏盒内的干燥剂，以防止干片受潮；定期对仪器进行维护保养，检查并调整标本加样枪头的位置以保障仪器检测结果的重复性[18]；定期更换光源，及时校正光路，且光路校正后须对仪器上所有检测项目重新定标[18]。
2.5 微量扩散法 此方法检测原理与干化学法相同，以单波长反射法检测试纸中氨指示剂与氨反应后颜色的深浅计算血氨的含量。检测时标本用量少且无需预先分离血浆(只需20 μL全血即可完成检测)，可使用末梢血，具有快速、操作简便等优点；试纸条独立包装易管理；同时使用此方法的仪器常可使用普通电池驱动，小巧易携带，解决了标本运输、放置时间及储存温度对检测结果的影响。因此，本方法越来越得到临床的认可，非常适合于POCT床旁检测，已成为急诊血氨检测又一新手段。文洪林等[15]使用EDTA抗凝静脉血对此方法与干化学法血氨检测结果一致性进行了评价，发现具有良好的一致性，差异无显著性(P>0.05)；任占宝等[20]使用肝素抗凝血也进行了相关研究，发现其灵敏度、特异性较高，误诊率和漏诊率低，在分析性能上优于谷氨酸脱氢酶法，能满足床旁血氨快速检测的需求。但因不同厂家生产的仪器和试剂的相关性能不同，购买时应注意厂家的选择，使用时应对其相关性能进行验证，同时建立此检测系统的正常人群参考区间，并定期与中心实验室的检测系统进行比对，纠正系统间的检测误差，最终使结果具有广泛的可比性。另一方面，人体内血氨浓度在血液中分布不同，动脉血中氨的含量为静脉血的0.5～2倍[21]，导致动脉血>末梢血(指血)>静脉血，因此使用此方法检测血氨时应确保标本来源一致，以便于病情与疗效的评估，医师分析时应充分考虑标本来源对检测结果的影响。
由于目前不同实验室间血氨的测定结果差异仍然很大，可能与校准品的稳定性和准确性有关。因为氨校准品在储存过程中氨会自动逸出，其逸出速度与所含氨浓度呈正比[22]，因此校准品宜采用低浓度的氨标准液，并放置于4 ℃冰箱中密封避光保存，校准时从冰箱中取出轻轻混匀，取适量后立即密封并放回冰箱中保存。质控品的保存也存在着同样的问题，室内质控失控分析时应考虑到校准品和质控品的稳定性因素，应加强校准品、质控品的管理。
4.1 环境 实验室空气中的氨是标本氨污染的原因，为减少标本和器皿受空气中氨的污染，应保障实验室内空气的质量，医院应严格禁烟，限制人员进出实验室，试验器皿使用前须经过特殊清洗[1]。
4.2 药物 常见药物对血氨检测无影响，但治疗水平的头孢西丁和英托利匹特注射液可分别使血氨浓度出现升高和降低，医生分析结果时应注意患者是否使用这些药物。
4.3 吸烟 吸烟对患者和标本都是氨污染的原因，如采血前1 h吸1支雪茄烟，可导致空腹静脉血氨浓度增加100～200 μg/L[1]。因此，血氨检测标本采集前1天的午夜后应禁止吸烟，医生分析结果时应注意患者是否有吸烟史。
综上所述，为保障向临床提供真实可靠的血氨检测结果，应加强从检验申请到医生解读检测结果整个流程中的质量控制；制定规范的标本采集手册和标本接收制度，并加强各环节工作人员的培训；检验科应做好检测方法的选择与评价，了解本系统检测结果的影响因素，并建立适用于本检测系统的正常人群参考区间，做好室内质控并定期与其他实验室进行结果比对，同时加强微量扩散法床旁检测血氨的质量管理及操作人员的培训工作，并定期与检验科检测结果进行比对；而医生分析血氨检测结果时，也要充分考虑患者的治疗史、吸烟史、标本来源与质量、抗凝剂种类、送检方式、样本周转时间、检测方法等因素对血氨结果的影响，加强临床与实验室的沟通，共同参与结果的解读。
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【中图分类号】R446.11+9
【文献标识码】A
DOI：10.11851/j.issn.1673-1557.2017.05.002
优先数字出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20170914.1646.034.html
(收稿日期：2016-11-02)
通信作者：肖光军，373984943@qq.com